干细胞培养需严格遵循血清处理、培养基配制、细胞操作等核心步骤，注重温度控制、无菌操作和细节管理以确保细胞活性与纯度。

背景与核心原则

干细胞培养是现代生物医学研究的基础技术，其成功依赖于对细胞微环境的精准调控。整个流程需在严格无菌条件下进行，涉及血清处理、培养基配制、细胞分离与传代等关键环节，任何操作失误都可能导致细胞分化、污染或活性下降。

关键步骤详解

一、血清的灭活与分装

血清作为干细胞培养的重要营养来源，其预处理直接影响培养效果。首先是化冻环节，需将血清从-20℃冰箱取出，可选择4℃冰箱化冻过夜，也可室温或浸于自来水中加速化冻。化冻后若不立即灭活，可暂时存放于4℃冰箱。灭活过程需将血清放入室温水浴锅，同时放入一个内装200ml自来水的血清瓶并插入温度计监控温度。当温度达到56℃时，需维持该温度30分钟±3分钟。若温度不小心超过56℃，需根据具体情况判断：未超过60℃且时间短（不超过5分钟）仍可使用；超过60℃或时间较长则建议弃用，或尝试用于ME细胞培养。灭活完成后，让血清自然冷却至室温（约1-3小时），随后进行分装。分装前需轻轻摇动血清使其混匀，用移液器操作时注意避免产生气泡，若有气泡可在酒精灯火焰上过一下去除。分装后需标好批号和日期，放入-20℃冰箱冻存，一次分装通常可使用1-2个月。

二、DMEM血清培养基的配制

提前一天将分装好的血清从-20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻。在细胞间内，按照特定比例将血清及其他添加成分（如丙酮酸钠、抗生素等）加入DMEM培养基中。以50ml体积的干细胞培养液为例，需加入适量的DMEM（高糖谷氨酰胺）、50ul非必需氨基酸、500ul丙酮酸钠、50ul双抗、7.5ml血清以及5ul LIF等成分。配制完成后做好标签，放入4℃冰箱保存备用。

三、原代胚胎成纤维细胞（ME）的制备

首先取12.5-13.5dpc孕鼠，断颈处死后将腹面向上放置，用70%酒精润湿消毒腹部，以防止腹毛飞扬污染内脏及子宫。接着剪开皮肤层和肌肉层，打开腹腔，剪去连接在子宫上的结缔组织及脂肪，将子宫取出并转入无菌10cm平皿中，然后把平皿转入超净台。在超净台内，用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏（主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等）。将处理后的鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次。弃去PBS后，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入适量Trypsin-EDTA消化，体积约等于组织块体积。用滴管轻轻吹匀，室温下消化1-10分钟（或至溶液浑浊变粘），随后加入与消化液等体积的培养基，轻轻吹打混匀（5-10次），静置后将上部溶液轻轻吸出转入离心管中。

注意事项与经验总结

在整个干细胞培养过程中，无菌操作是重中之重，所有操作需在超净台内进行，移液器、培养皿等器材需提前消毒。温度控制也极为关键，无论是血清灭活的56℃恒温，还是细胞培养的适宜温度，都需精准把控。血清的质量和批号差异可能影响培养结果，建议选择优质血清并进行批次测试。培养基配制时，各成分的比例需准确无误，添加顺序和操作手法也需规范，以保证培养基的稳定性和营养成分的活性。此外，实验过程中需做好详细记录，包括试剂批号、操作时间、细胞状态等，以便后续追溯和分析。通过严格遵循上述步骤和注意事项，可有效提高干细胞培养的成功率，为后续的研究工作奠定坚实基础。