基因编辑技术正重塑细胞工厂的构建范式，从CRISPR-Cas9的精准靶向到高通量筛选高产细胞系，形成了一套高效、可编程的代谢工程体系。以下从技术迭代、多基因调控、筛选策略三方面展开论述：

一、CRISPR系统迭代：从Cas9到新型编辑工具

CRISPR-Cas9的基础突破

CRISPR-Cas9通过向导RNA（gRNA）引导Cas9核酸酶靶向切割DNA双链，依赖细胞自身的非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）实现基因敲除或插入。其优势在于设计简便、成本低，适用于如CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、HEK293等工业化宿主。然而，Cas9依赖PAM序列限制靶点选择，且双链断裂可能引发染色体异常。

CRISPR-Cas12a/Cpf1的多重编辑升级

Cas12a/Cpf1系统突破Cas9局限：①识别富含胸腺嘧啶的PAM序列，拓展靶点范围；②通过tRNA加工机制释放多gRNA阵列，实现单载体递送9-10个gRNA。例如在黑曲霉中，研究者构建多gRNA质粒同步删除多个基因，将细胞工厂构建周期缩短60%，加速柠檬酸、淀粉酶等产物的路径优化。

新型编辑工具拓展应用场景

逆转录酶编辑：无需DNA断裂，直接以RNA为模板修复突变，降低脱靶风险；

CRISPR-Cas13靶向RNA：调控转录本稳定性，动态平衡代谢通量。

二、多基因代谢路径重构：从单点敲除到全局优化

多重编辑攻克复杂通路

传统迭代式编辑效率低下，而CRISPR多重编辑可同步调控整条代谢路径：

裂殖壶菌脂肪酸工程：通过CRISPR-Cas9同时过表达脂质合成酶并抑制竞争路径，使DHA比例提升至55.1%，油脂含量达77.14%；

毕赤酵母系统升级：利用CRISPR整合甲醇诱导型启动子（AOX1）和过氧化物酶体增殖模块，强化萜类化合物合成空间分隔，解决毒性中间产物累积问题。

表观遗传与代谢重编程

染色质重塑因子（如CHD7）通过调控染色质开放性影响关键基因表达。在急性髓系白血病细胞中，CHD7缺失导致血管生成素ANGPT1上调，激活PI3K/AKT通路，赋予细胞化疗耐药性。类似机制可反向应用于细胞工厂，通过编辑表观基因增强环境胁迫耐受性。

三、高产细胞系筛选：从低效克隆到智能筛选

CRISPR文库高通量筛选

全基因组CRISPR敲除文库（如GeCKO v2.0）结合负向选择，可系统性鉴定影响产物合成的必需基因：

三阴性乳腺癌模型：筛选出TONSL、TIMELESS、RFC3、RAD51等肿瘤依赖基因，其调控的C6上皮亚群与能量代谢重编程直接相关，敲除后显著抑制细胞增殖；

反义寡核苷酸（ASO）活性调控：通过CRISPR筛选发现内体-高尔基体转运蛋白AP1M1和TBC1D23，优化其表达可提升核酸药物核质转运效率。

多组学整合与机器学习预测

单细胞转录组+CRISPR筛选：在TNBC中整合单细胞测序与CRISPR数据，定位高代谢活性亚群并预测其分化轨迹，指导靶向代谢改造；

代谢通量模型指导编辑：结合基因组规模代谢模型（GSMM），预测敲除目标基因对产物得率的影响，优先筛选如GLUT4（葡萄糖转运体）等调控节点。

四、工业化落地：从实验室到生产线

稳定细胞系构建策略

位点特异性整合：利用CRISPR将外源基因靶向插入基因组热点（如CHO的HPRT位点），避免表达沉默；

无标记筛选系统：基于CRISPR敲除营养缺陷基因（如pyrG、argB），替代抗生素抗性筛选，符合GMP规范。

过程强化与智能监控

通过在线拉曼光谱实时监测代谢物浓度，动态调整补料策略。例如在毕赤酵母发酵中，甲醇诱导型启动子配合葡萄糖梯度控制，使异源蛋白表达量突破10g/L

未来挑战与方向

尽管基因编辑大幅加速细胞工厂开发，仍面临脱靶效应、多基因表达失衡等问题。下一代技术将聚焦：

① 人工智能驱动gRNA设计：预测高活性且低脱靶的gRNA序列；

② 动态调控回路：利用光控或代谢物感应开关精细调节基因表达；

③ 非模型宿主适配：拓展至丝状真菌、微藻等工业菌株，解锁更复杂产物合成能力。