胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）作为细胞培养的核心添加剂，其生产流程需严格遵循无菌化、标准化操作，确保生物活性与安全性。以下是关键环节的质量控制要点：

一、供体筛选与采血

健康孕牛选择

供体为妊娠5-8月龄的健康母牛，需来自无疫病（如疯牛病、口蹄疫）的封闭牧场，确保无抗生素或激素使用史。

胎牛取出前，母牛经全身麻醉结合局部麻醉，采用侧卧保定法固定，降低应激反应对血清成分的影响。

无菌心脏穿刺采血

在万级洁净室内，对胎牛心脏部位消毒（碘酒+酒精双重处理），通过无菌穿刺针采集血液，避免红细胞破裂导致血红蛋白污染。

血液直接流入预处理的采血瓶（含灭菌生理盐水润壁），全程封闭操作，防止微生物侵入。

二、血液处理与初分离

低温离心分离

采集血液在4℃静置4小时，促使自然凝结；随后以3400-3800 rpm离心30分钟，分离血细胞与上层血清。

离心后仅取澄清上清液，避免触碰沉淀层，减少纤维蛋白原残留。

粗血清冻存

分离的血清立即分装，于-20℃以下速冻保存，防止蛋白降解。冻存容器预留10%扩容空间，避免冻裂。

三、精细过滤与除菌

多级微孔过滤

解冻粗血清后，依次通过预过滤（去除大颗粒杂质）和三级0.1μm微滤膜，彻底清除细菌、支原体及病毒。

采用切向流过滤（Tangential Flow Filtration）技术，减少滤膜堵塞，提高过滤效率。

过滤环境控制

过滤在百级洁净室进行，正压环境下操作，空气经HEPA高效过滤，实时监测微粒数与压差。

四、质量控制与分装

理化与生物指标检测

内毒素：≤10 EU/ml（部分优质批次可低至1-3 EU/ml），确保无热原污染。

血红蛋白：≤20 mg/dl，反映采血过程是否规范。

微生物：无菌检验（细菌、真菌、支原体）、病毒筛查（如牛腹泻病毒）均为阴性。

功能性测试：通过细胞增殖实验（如Sp2/0细胞系），验证倍增时间≤15小时，克隆形成率≥90%。

分装与冻存

过滤后血清在百级超净台下分装，避免二次污染；分装瓶预冷，灌装后迅速-20℃以下冷冻。

批次记录可追溯：标注母牛编号、采血日期、过滤参数及质检结果。

五、储存与运输

长期储存：-20℃至-40℃避光保存，避免反复冻融（建议分装50ml/瓶）。4℃临时存放不超过1个月。

解冻规范：

阶段1：-20℃移至4℃冰箱，缓慢解冻12-24小时；

阶段2：室温平衡并轻柔摇匀，禁止直接37℃水浴（易析出沉淀）。

关键工艺优化点

批次稳定性控制：混合多胎牛血清原料，扩大单批次产量（最高达2000-3000升），减少批间差异。

避免热灭活：非必要不进行56℃热处理（破坏生长因子，增加沉淀），仅免疫学研究等特定需求使用。

沉淀物处理：解冻后絮状物多为脂蛋白或纤维蛋白，非污染迹象；必要时400g离心5分钟去除，禁止过滤（堵塞滤膜）。

此流程通过源头管控、无菌操作、多级过滤及严苛质检，确保胎牛血清的高生物活性与安全性，满足细胞培养对营养成分、生长因子及低毒素的核心需求。