基于细胞融合技术的单克隆抗体制备操作指南

一、技术原理概述

单克隆抗体（McAb）是由单一B淋巴细胞克隆产生的、仅针对特定抗原表位的高特异性抗体。其制备核心是杂交瘤技术：通过将免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成兼具B细胞抗体分泌能力和骨髓瘤细胞无限增殖特性的杂交瘤细胞，最终实现单一抗体的规模化生产。

二、关键操作流程

1. 实验前准备

动物免疫：

动物选择：6-8周龄雌性Balb/c小鼠（与骨髓瘤细胞同源）。

抗原制备：

可溶性抗原（如重组蛋白）：需与弗氏佐剂（完全/不完全）乳化，增强免疫原性。

颗粒性抗原（如病毒）：可直接注射，无需佐剂。

免疫程序：

初次免疫：抗原（50–100 μg）皮下或腹腔注射；

加强免疫：间隔2–3周重复注射，末次免疫后3–4天取脾。

细胞准备：

骨髓瘤细胞：选用SP2/0或P3-X63-Ag8.653等HGPRT缺陷型细胞株，融合前24小时传代至对数生长期。

饲养层细胞：取同源小鼠腹腔巨噬细胞，提供生长因子支持杂交瘤存活。

2. 细胞融合与筛选

细胞融合步骤：

取免疫小鼠脾脏制备单细胞悬液，与骨髓瘤细胞按（5–10）:1比例混合；

离心去上清，缓慢加入50% PEG-4000（pH 8.0）诱导融合，37℃静置90秒；

逐滴加入无血清培养基终止反应，离心后重悬于HAT选择培养基。

杂交瘤筛选：

HAT培养基选择原理：

氨基蝶呤阻断DNA合成主途径；

骨髓瘤细胞（HGPRT⁻）死亡，脾细胞自然凋亡；

仅杂交瘤细胞利用旁路途径存活。

抗体检测：

初筛（融合后10–14天）：采用ELISA、Western Blot筛选抗原结合阳性孔；

克隆化：阳性孔细胞有限稀释法分至96孔板，确保单克隆性。

3. 单克隆抗体的生产与纯化

大规模制备：

体内诱生法：杂交瘤细胞注射于预处理（降植烷注射）的小鼠腹腔，1–2周后采集腹水，抗体浓度可达1–10 mg/mL。

体外培养法：杂交瘤细胞在含10%胎牛血清的培养基中悬浮培养，收集上清液，抗体产量较低但纯度更高。

抗体纯化：

采用Protein A/G亲和层析，结合pH梯度洗脱，获得＞95%纯度的IgG。

三、常见问题与优化策略

融合率低：

优化PEG浓度（40–50%）及作用时间（1–2分钟）；

确保细胞处于对数生长期。

抗体特异性不足：

加强抗原纯度控制；

增加克隆化筛选轮次（≥3次）。

支原体污染：

定期检测细胞系，添加抗生素（如Plasmocin）。

四、应用与质量控制

诊断应用：ELISA试剂盒、肿瘤成像（荧光标记抗体）。

治疗应用：抗体药物偶联物（ADC），如靶向递送细胞毒素至肿瘤细胞。

质控指标：

效价（ELISA滴度＞1:10⁴）；

亲和力（表面等离子共振技术测定）；

无菌性与内毒素检测。

五、技术展望

随着基因工程与AI辅助设计的发展，重组单克隆抗体（如纳米抗体）正逐步替代传统杂交瘤技术，其制备周期短、人源化程度高，在精准医疗领域潜力显著。

本指南聚焦经典杂交瘤技术流程，实际操作需结合实验室条件优化参数，并严格遵守无菌操作规范。