细胞培养技术概述与分类

细胞培养是指在人工模拟体内环境（无菌、适宜温度及酸碱度）下，为细胞提供充足营养，使其生长繁殖并维持结构功能的技术，是生物医学研究的核心基础手段。根据细胞来源和特性，可分为三大类：原代细胞直接取自体内组织，保留体内原始状态但获取难度大；细胞系由原代细胞传代后形成，包括可连续传代的无限细胞系和有限传代的有限细胞系；细胞株则是通过筛选获得的具有特定标志物的细胞群。按生长方式可分为贴壁细胞（需附着支持物生长）、悬浮细胞（培养液中悬浮生长）和半贴壁细胞（部分贴附部分悬浮）。

细胞培养前的准备工作

培养体系选择

培养基类型：天然培养基（组织提取液）成分复杂但营养丰富，合成培养基（如1640、DMEM）成分明确，无血清培养基（如X-VIVO系列）适用于长周期培养和严格质控需求。

血清添加：常用胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，浓度多为5%-20%，10%为最常见浓度。血清需经56℃灭活30分钟去除补体，但会损失部分有益成分。

辅助试剂：双抗（青霉素+链霉素）或三抗（加两性霉素B）可预防污染，但长期培养应避免持续使用以防耐药性；酚红作为pH指示剂，在激素敏感实验中需慎用。

培养条件参数

温度：哺乳动物细胞36-37℃，昆虫细胞27℃，温度波动会显著影响代谢活性。

气体环境：多数细胞需5-7%CO₂维持培养基pH（哺乳动物细胞pH7.4，昆虫细胞pH6.2），培养箱湿度通过水盘保障。

渗透压：人细胞理想值290mOsm/kg，鼠细胞约320mOsm/kg，由培养基盐浓度决定。

无菌环境准备

操作区域消毒：超净工作台提前紫外照射30分钟（紧急情况不少于15分钟），75%酒精擦拭台面及耗材。

人员防护：穿戴细胞房专用拖鞋、头套、口罩、实验服，双层手套需包裹袖口。

设备维护：显微镜定期酒精消毒，培养箱定期检查CO₂储备，移液器等工具专用并避免交叉污染。

细胞培养核心操作流程

细胞复苏（以HNEpC细胞为例）

快速解冻：从液氮罐取出冻存管，立即放入37℃水浴轻柔摇晃，加速解冻同时避免细胞受热损伤。

细胞接种：解冻后细胞悬液用培养基稀释，按5×10⁴-1×10⁵个细胞/25cm²培养瓶密度接种，轻轻摇晃使细胞均匀分布。

培养条件设置：置于37℃、5%CO₂培养箱，保持饱和湿度，次日观察细胞贴壁情况。

细胞传代（贴壁细胞流程）

清洗细胞：倒掉旧培养基，用无菌PBS缓冲液轻柔清洗2-3次，去除残留血清和代谢废物。

胰酶消化：加入足量含EDTA的0.25%胰蛋白酶（300-400μl/培养瓶），覆盖所有细胞后37℃孵育1-3分钟，显微镜下观察细胞间隙增大、变圆但未脱落时终止消化。

终止消化与吹打：加入含血清培养基（1800μl/瓶）终止胰酶活性，用移液枪轻柔吹打瓶底使细胞完全脱离，形成单细胞悬液。

离心重悬：细胞悬液转移至离心管，800-1200rpm离心5分钟，弃上清后用新鲜培养基重悬，按1:2或1:3比例接种到新培养瓶。

细胞培养日常维护

状态观察：每日显微镜观察细胞形态（如上皮细胞呈多边形、连接紧密）、密度及有无污染，当细胞融合度达80-90%时及时传代。

培养基更换：根据细胞代谢情况每2-3天更换培养基，悬浮细胞需离心后更换新鲜培养基。

污染处理：若发现细菌污染（培养基浑浊、pH骤降）或真菌污染（出现絮状沉淀），立即丢弃污染细胞，彻底消毒培养箱及操作区域。

细胞计数与密度调整

细胞悬液制备：取少量细胞悬液与台盼蓝染液按1:1混合，活细胞拒染呈无色，死细胞被染成蓝色。

计数操作：使用血细胞计数板计数四角大方格内活细胞数，按公式计算细胞密度（细胞数/ml=四大格平均细胞数×稀释倍数×10⁴）。

密度调整：根据实验需求稀释至目标密度（如5万/ml），确保后续实验的细胞浓度一致性。

细胞培养关键注意事项

无菌操作要点

操作规范：避免在工作台边缘操作，试剂瓶口远离气流区，开盖后瓶口过火（酒精灯外焰）消毒。

耗材使用：所有培养器皿需无菌，吸管、移液枪头一次性使用，避免交叉污染。

环境监控：定期对培养箱、超净台进行无菌检测（如沉降菌培养），发现污染立即追溯原因并彻底清洁。

细胞状态维持

消化控制：严格控制胰酶消化时间，避免消化过度导致细胞损伤（细胞变圆脱落为过度标志）。

吹打力度：吹打细胞时保持轻柔，避免产生气泡和机械剪切力对细胞的破坏。

环境稳定：减少细胞在培养箱外暴露时间，转移过程轻拿轻放，避免剧烈震动影响细胞贴壁。

试剂管理规范

试剂分装：培养基、血清、胰酶等易变质试剂需分装保存，避免反复冻融，标记分装日期和批号。

储存条件：血清-20℃冻存，培养基4℃避光保存，使用前预热至37℃但避免反复加热。

质量检测：新批次试剂需进行无菌性和细胞毒性测试，确保不影响细胞生长。

常见问题处理

细胞生长缓慢：检查培养基pH、血清质量及培养箱温度，排除支原体污染可能，必要时调整接种密度。

细胞形态异常：若出现空泡、皱缩等现象，可能为营养缺乏或污染前兆，及时更换新鲜培养基并观察变化。

交叉污染预防：不同细胞系操作需更换手套和耗材，严格标记培养瓶信息，避免同名标签混淆。

通过严格遵循上述流程和注意事项，可有效保障细胞培养的成功率和实验结果的可靠性，为后续基础研究或应用开发提供高质量的细胞模型。