细胞工程细胞储存全流程指南：从样本采集到复苏活性维持的标准化操作

当某干细胞制剂因样本运输时温度波动0.5℃导致复苏活率从90%降至50%；当某免疫细胞库因冻存管标识不清导致样本混淆，最终引发医疗纠纷；当某CAR-T细胞因复苏时操作过快，细胞内形成冰晶导致活性完全丧失——这些案例揭示了细胞储存的残酷现实：从样本采集到复苏的任何一个环节出现疏漏，都可能让前期数月的努力付诸东流。细胞储存的核心目标是维持细胞的生物学活性与功能，而这需要建立一套覆盖“采集-运输-制备-冻存-复苏”全流程的标准化操作体系。本文将以“质量控制+风险防范”为核心，为你构建一套可落地的细胞储存全流程操作指南，帮助企业实现细胞活性的最大化维持。

一、样本采集：从源头保障细胞“初始活性”

样本采集是细胞储存的起点，也是影响细胞质量的关键环节。不同类型细胞（如干细胞、免疫细胞、肿瘤细胞）的采集方式与质量标准存在差异，但核心原则是“减少细胞损伤、避免污染、维持活性”。

1. 采集前准备：从“人员”到“设备”的全面质控

人员培训：采集人员需接受专业培训，熟练掌握不同样本的采集技术、无菌操作规范及应急处理流程。采集前需核对人员资质、设备状态及试剂有效期，确保所有操作符合GMP要求。

设备与试剂准备：根据样本类型选择合适的采集设备（如一次性采血针、组织活检针等），所有设备需经校准与灭菌处理；采集试剂需提前预热至37℃（如培养基、抗凝剂），避免因温度骤变导致细胞损伤。

供体评估：采集前需对供体进行全面评估，包括健康状况、传染病筛查（如HIV、HBV、HCV）、遗传病史等。对于自体细胞储存，需确保供体无近期感染、未服用影响细胞活性的药物（如免疫抑制剂）；对于异体细胞，需进行HLA配型及组织相容性检测。

2. 采集操作：针对不同细胞类型的“精准策略”

外周血免疫细胞采集：采用血细胞分离机进行单采，采集过程中需控制血流速度（50-70 mL/min）、抗凝剂比例（ACD-A：血液=1:10），避免因抗凝剂过多导致细胞聚集或过少引发凝血。采集完成后，需立即对样本进行细胞计数与活力检测，确保活细胞比例≥90%，目标细胞群（如CD3+T细胞）纯度≥70%。

脐带/胎盘干细胞采集：采集需在分娩后10-30分钟内完成，采用无菌操作剪取脐带组织或收集胎盘血。脐带间充质干细胞采集时，需用无菌生理盐水冲洗脐带表面血迹，避免血液污染；胎盘血采集需使用专用采血袋，避免空气进入导致溶血。

实体肿瘤细胞采集：手术切除的肿瘤组织需立即置于4℃无菌培养基中，避免干燥或温度过高导致细胞坏死。采集后需在30分钟内进行组织解离，避免细胞缺氧时间过长。对于穿刺样本，需选择合适的穿刺针（如20G针），确保获取足够的活细胞，避免因穿刺过深导致组织坏死。

3. 样本标识：建立可追溯的“身份系统”

唯一性标识：每个样本需分配唯一标识（如条形码、二维码），包含供体信息、样本类型、采集时间、采集人员等关键数据。标识需采用耐低温、耐化学腐蚀的材料（如聚酯纤维标签），确保在冻存与复苏过程中不脱落、不模糊。

双码核对制度：采集过程中需进行两次标识核对（采集前、采集后），避免样本混淆。转运时需将标识信息同步至电子系统，建立从采集到储存的全流程追溯链。

二、样本运输：维持细胞活性的“温度控制链”

样本运输是细胞储存的“中间防线”，温度波动、缺氧、机械损伤是导致细胞活性下降的主要原因。需根据细胞类型与运输距离，建立针对性的运输方案。

1. 温度控制：不同细胞的“温度阈值”

常温运输：适用于短距离（≤4小时）运输的外周血样本，需使用带有温度监控的保温箱，维持温度在20-25℃。运输过程中避免剧烈摇晃，防止细胞破碎。

冷藏运输：适用于干细胞、肿瘤细胞等需短期保存的样本，温度控制在2-8℃。运输容器需采用泡沫箱结合冰袋，确保温度波动≤±1℃。运输时间尽量控制在24小时内，若超过24小时，需添加细胞活力保护剂（如ATP、谷胱甘肽）。

冷冻运输：适用于需长期运输的冻存细胞，温度需维持在-150℃以下（如液氮干冰罐）。运输过程中需实时监测温度，确保温度不高于-140℃，避免细胞内冰晶形成。

2. 运输防护：避免机械损伤与污染

防震包装：样本容器需采用缓冲材料包裹（如泡沫垫、海绵），避免运输过程中因颠簸导致细胞破碎。冻存管需采用专用运输盒，防止碰撞导致管盖松动。

无菌防护：所有运输容器需经灭菌处理，样本容器需密封，避免外界污染物进入。对于肿瘤细胞等具有生物危险性的样本，需采用双层包装，并标注生物危害标识。

3. 运输监控：全流程数据记录

温度监控：运输容器内需放置温度记录仪，每15分钟记录一次温度，确保运输过程中温度符合要求。运输完成后，需导出温度数据并存档。

状态监控：运输人员需在出发前、中途、到达后对样本状态进行检查，包括容器完整性、样本是否泄漏等。若发现异常，需立即联系实验室，评估样本是否符合接收标准。

三、样本制备：从“原始样本”到“储存细胞”的精准转化

样本制备是将原始样本转化为可储存细胞的核心环节，包括细胞分离、纯化、扩增等操作。该环节的目标是去除杂质细胞与污染物，富集目标细胞群，并维持细胞活性。

1. 细胞分离与纯化：针对不同细胞的“专属方案”

密度梯度离心法：适用于外周血单个核细胞（PBMC）的分离，采用淋巴细胞分离液（Ficoll）进行密度梯度离心，离心速度控制在400g、离心时间30分钟，避免离心力过大导致细胞破碎。分离后需用PBS清洗3次，去除血小板与红细胞。

磁珠分选法：适用于高纯度目标细胞的富集（如CD3+T细胞、CD133+干细胞），采用免疫磁珠标记目标细胞，通过磁分离柱分离出目标细胞群。分选前需调整细胞浓度至1×10^7/mL，磁珠与细胞比例控制在1:10，确保标记效率≥90%。

组织解离法：适用于实体组织细胞的分离，采用酶解法（如胶原酶、胰蛋白酶）结合机械研磨。酶解温度控制在37℃，酶解时间根据组织类型调整（如肿瘤组织1-2小时，脂肪组织30分钟），避免酶解过度导致细胞损伤。解离后需用滤网（100μm）过滤，去除组织碎片。

2. 细胞质量检测：储存前的“质量关卡”

活性检测：采用台盼蓝染色法检测细胞活率，活细胞比例需≥85%；采用流式细胞术检测细胞凋亡率，凋亡率需≤5%。对于干细胞，需检测其增殖能力与分化潜能，确保符合储存标准。

纯度检测：采用流式细胞术检测目标细胞群纯度，如CAR-T细胞的CD3+CAR+双阳性率需≥70%，间充质干细胞的CD73+CD90+CD105+阳性率需≥95%。

污染检测：需进行细菌、真菌、支原体及内毒素检测，细菌与真菌培养需无菌生长，支原体检测需阴性，内毒素含量需≤0.5 EU/mL。对于病毒载体修饰的细胞，需检测病毒滴度及整合效率。

3. 细胞分装与标识：储存前的“最后一步”

分装规范：根据细胞类型与储存需求，选择合适的冻存管（如2mL、5mL冻存管），每管细胞数量控制在1×10^6-1×10^7个/mL。分装过程中需避免气泡产生，防止冻存时冰晶形成。

标识完善：冻存管标识需包含样本唯一编号、细胞类型、细胞数量、冻存日期等信息。标识需采用耐低温的马克笔或热转印打印，确保在-196℃环境下清晰可读。分装完成后，需再次核对标识信息，避免样本混淆。

四、细胞冻存：让细胞“休眠”的艺术

细胞冻存是通过降低温度抑制细胞代谢活动，实现长期储存的过程。核心原则是“慢冻速融”，避免细胞内形成冰晶导致细胞膜破裂。

1. 冻存液制备：保护细胞的“营养盾牌”

基础冻存液配方：常用冻存液为90%胎牛血清（FBS）+10%二甲基亚砜（DMSO）。DMSO作为渗透型保护剂，可降低细胞冰点，防止细胞内冰晶形成；血清则提供非渗透性保护物质（如白蛋白、蔗糖），减少细胞脱水损伤。

无血清冻存液选择：对于临床级细胞储存，需选择无血清冻存液替代血清，避免血清带来的病原体污染与免疫排斥风险。无血清冻存液通常含有重组白蛋白、海藻糖等保护剂，效果与血清冻存液相当，但安全性更高。

个性化冻存液优化：针对不同细胞类型，可调整冻存液成分。如干细胞冻存液可添加生长因子（如EGF、bFGF），维持细胞的干细胞特性；免疫细胞冻存液可添加抗氧化剂（如维生素E），减少细胞氧化损伤。

2. 冻存程序：控制降温速度的“精密操作”

程序降温法：采用程序降温仪或梯度降温盒，以1-2℃/min的速度从4℃降至-80℃，然后转入液氮罐（-196℃）储存。程序降温仪可精确控制降温速度，是临床级细胞冻存的首选方式；梯度降温盒则通过异丙醇的缓慢降温，模拟程序降温效果，适用于实验室小规模冻存。

直接冻存法：仅适用于耐受性较强的细胞株（如HeLa细胞），将分装完成的冻存管直接放入-80℃冰箱，24小时后转入液氮罐。该方法操作简单，但细胞活率较低，不适合临床级细胞储存。

低温保护剂预处理：对于敏感细胞（如造血干细胞），冻存前可将细胞置于含有10%DMSO的培养基中，4℃预处理30分钟，使细胞逐渐适应低温环境，减少冻存损伤。

3. 冻存管理：确保储存安全的“动态监控”

液氮罐维护：定期检测液氮罐的液位与压力，确保液氮液位不低于总容量的1/3。液氮罐需放置在通风良好、温度稳定的环境中，避免阳光直射与剧烈震动。

样本位置管理：建立冻存样本的电子位置图，记录每个冻存管的货架号、层数、位置编号，便于快速查找。每次存取样本后，需更新电子位置图，避免位置混淆。

定期质量抽检：每年需对冻存样本进行抽检，检测细胞活率、纯度及功能。抽检样本数量不低于总样本量的1%，若发现细胞活性下降超过10%，需评估冻存条件是否存在问题，并及时调整。

五、细胞复苏：让细胞“苏醒”的关键步骤

细胞复苏是细胞储存的“终端出口”，核心目标是快速恢复细胞活性，减少细胞损伤。复苏过程需遵循“速融慢复”的原则，避免冰晶融化时对细胞造成二次损伤。

1. 复苏前准备：确保环境与试剂就绪

试剂预热：复苏用培养基需提前预热至37℃，避免细胞从-196℃直接接触低温培养基导致损伤。培养基需添加10%-20%胎牛血清，提供细胞复苏所需的营养物质。

设备检查：复苏用离心机、培养箱需提前开启，确保离心转速准确、培养箱温度与CO2浓度稳定（37℃、5%CO2）。

样本定位：复苏前需根据电子位置图查找冻存管位置，避免在液氮罐中长时间停留，导致样本温度升高。取出冻存管时需佩戴防冻手套，避免液氮冻伤。

2. 复苏操作：快速解冻与温和处理

快速解冻：将冻存管立即放入37℃水浴锅中，快速摇动冻存管，使其在1-2分钟内完全融化。避免解冻时间过长，导致细胞内冰晶重新形成。解冻过程中需注意水浴锅水位不超过冻存管盖，避免样本污染。

温和清洗：解冻后，需用移液枪缓慢将细胞悬液转移至含有预热培养基的离心管中，避免细胞受到机械冲击。清洗过程中需用PBS稀释细胞悬液，逐步降低DMSO浓度，避免DMSO对细胞的毒性作用。通常需清洗3次，每次离心速度控制在300g、离心时间5分钟。

轻柔接种：清洗完成后，将细胞接种至培养瓶中，放入培养箱中培养。接种密度需根据细胞类型调整，如贴壁细胞接种密度为1×10^4-1×10^5个/cm²，悬浮细胞接种密度为1×10^5-1×10^6个/mL。接种后需避免剧烈摇晃，让细胞自然沉降。

3. 复苏后培养与质量检测

培养条件优化：复苏后24小时内避免换液，让细胞适应培养环境。对于敏感细胞，可添加细胞活力促进剂（如胰岛素、转铁蛋白），提高细胞存活率。培养过程中需每天观察细胞状态，及时更换培养基，去除死细胞碎片。

质量检测：复苏后24-48小时，需检测细胞活率、纯度及功能。如免疫细胞需检测其增殖能力与杀伤活性，干细胞需检测其分化潜能。若细胞活率低于70%，需分析复苏过程是否存在问题，并调整复苏方案。

六、全流程质量控制：构建“零缺陷”的管理体系

细胞储存的标准化操作离不开完善的质量控制体系，需建立“人员-设备-工艺-文件”四位一体的质控模式。

1. 人员培训与资质管理

分级培训：针对不同岗位人员（如采集人员、制备人员、复苏人员）制定分级培训计划，培训内容包括操作规范、质量控制、应急处理等。培训后需进行考核，合格后方可上岗。

定期复训：每年需对人员进行复训，更新知识与技能。对于新设备、新工艺的引入，需进行专项培训，确保人员掌握操作方法。

2. 设备校准与维护

定期校准：所有设备（如离心机、培养箱、程序降温仪）需定期进行校准，校准周期根据设备类型与使用频率确定（如每月、每季度）。校准结果需记录并存档，确保设备性能符合标准。

预防性维护：建立设备维护计划，定期对设备进行清洁、润滑、更换部件等维护。对于关键设备（如液氮罐、流式细胞仪），需配备备用设备，避免因设备故障导致生产中断。

3. 工艺验证与持续改进

工艺验证：新的储存工艺（如无血清冻存、自动化复苏）需进行工艺验证，包括工艺性能确认（PQ）与工艺性能验证（PPQ），确保工艺稳定可靠。验证结果需形成验证报告，作为工艺实施的依据。

持续改进：定期分析生产数据，识别质量风险与改进机会。如通过统计过程控制（SPC）分析细胞活率数据，发现活率下降趋势，及时调整冻存液配方或复苏操作流程。建立偏差管理与纠正预防措施（CAPA）体系，对质量问题进行根本原因分析，并采取措施防止问题再次发生。

4. 文件管理与记录追溯

文件体系建立：建立完善的文件体系，包括操作规程（SOP）、质量标准、记录表格等。文件需经过审批后方可发布，确保文件的科学性与可操作性。

记录完整性：所有操作过程需进行记录，包括人员、设备、时间、参数、结果等关键信息。记录需真实、准确、完整，不得涂改。记录保存期限需符合法规要求（如不少于产品有效期后5年）。

结语：标准化是细胞储存质量的“护城河”

细胞储存的核心目标是维持细胞的生物学活性与功能，而这离不开全流程的标准化操作。从样本采集时的精准控制，到复苏后的活性维持，每一个环节都需严格遵循操作规范，才能确保细胞在储存数年后仍能保持良好的活性与功能。

随着细胞工程技术的不断发展，细胞储存的需求将日益增长。建立一套科学、规范、可复制的细胞储存全流程操作体系，不仅是保障细胞质量的关键，也是推动细胞治疗产品商业化的基础。未来，随着自动化、智能化技术的引入，细胞储存的标准化操作将更加高效与精准，为更多患者带来希望